style="width:5.34666in;height:3.93998in" /> 本文是学习GB-T 33249-2016 纳米技术 活细胞内金纳米棒含量测定 消光光谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了采用紫外/可见/近红外消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的方法。
本标准适用于定量测量活细胞内金纳米棒结构的含量，定量测量活细胞内其他棒状贵金属纳米结
构的含量亦可参照本标准执行。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 24369.1—2009 金纳米棒表征 第1部分：紫外/可见/近红外吸收光谱方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
消光光谱 extinction spectrum
待测物质浓度和消光池厚度不变时，消光度(或消光度的任意函数)对应波长(或波长的任意函数)
的曲线。
注：修改 GB/T 9721—2006,定义3.2。
3.2
表面等离激元共振 surface plasmon resonance;SPR
当入射电磁波照射到金属表面上时，金属中的自由电子在电场的驱动下相对于正离子的晶格以一
定的频率发生相干振荡。
[GB/T 24369.1—2009,定义3.2]
3.3
金纳米棒 gold nanorods(AuNRs)
由金元素构成的纳米尺度的棒状颗粒，其在一个维度上的尺度与其他两个维度之比均大于1。在
尺度较小的两个维度上的尺寸应介于1nm～100 nm 之间。
金纳米棒表面等离激元共振具有两个特征消光带，根据紫外/可见/近红外吸收光谱方法(见
GB/T
24369.1—2009)得到金纳米棒的消光光谱图，见图1a),其中横向等离激元共振峰(1)在480
nm~ 600 nm
之间，其峰面积与金纳米棒的浓度正相关；纵向表面等离激元共振峰(2)位于近红外光谱区，其
峰位由金纳米棒的轴比、形状和外部介电环境决定。体外活细胞的磷酸盐缓冲液(PBS)
悬液对峰1无
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影响(图1b)曲线a],计算时作为背景曲线扣除后，就获得了细胞内金纳米棒的消光光谱。
PBS 和聚集
状态基本上都不影响峰1。通过计算扣除背景后的横向表面等离激元共振峰面积得到细胞中的金纳米
棒含量。
style="width:5.34666in;height:3.93998in" />
波长/nm
a) 金纳米棒水溶胶的消光光谱
说明：
实线—— 曲线 a;
虚线—— 曲线 b;
style="width:5.42658in;height:3.8599in" />
波长/nm
b) 人乳腺癌细胞(MDA-MB-231) 摄取金纳米棒
前(曲线 a)、后(曲线 b)的消光光谱
图 1 金纳米棒的消光光谱
具有测量消光光谱测量功能的酶标仪，波长扫描范围：400 nm～999 nm。
使用前对酶标仪进行
校准。
金纳米棒的制备实例参见附录 A。
称取8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO 和0.24 gKH₂PO, 加超纯水定容至1000
mL。 所用试
剂均为分析纯
与金纳米棒孵育后，贴壁细胞用常规胰酶消化，非贴壁细胞直接室温离心，弃上清液。收获的细胞
加入适量 PBS 缓冲液洗涤3遍，用于细胞计数和后续的测定。
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利用细胞计数板计数不少于3次，取平均值。
7.2.1 在酶标仪上设定波长范围、吸光度范围、扫描速度等测量参数。
7.2.2
向酶标板中加入与金纳米棒共同孵育后的细胞悬液200μL,未经金纳米棒处理的细胞悬液作为
对照。扫描后扣除对照光谱，得到细胞中金纳米棒的光谱。
计算图2中阴影部分(峰1)的面积。参照附录 B。
style="width:6.4933in;height:5.0534in" />
波长/nm
说明：
1——横向等离激元共振峰；
2——纵向等离激元共振峰。
图 2 峰面积的计算
8.2 细胞中金纳米棒含量模拟标准曲线的建立
8.2.1
将未经金纳米棒处理的活细胞悬液计数，室温离心，弃上清液，加入超纯水，按常规方法制备细
胞裂解液。
8.2.2
将呈梯度浓度的金纳米棒溶胶分散于8.2.1的细胞裂解液中，测试体积为200μL,
得到消光光
谱；扣除细胞裂解液的背景光谱。参见8.1的方法计算峰面积，做标准曲线，见图3。
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style="width:6.38663in;height:4.8268in" />
细胞裂解液中金纳米棒浓度/(μg/mL)
图 3 峰 1面积与裂解液中金纳米棒浓度的标准曲线
根据标准曲线，计算出金纳米棒的含量，除以细胞总数，获得单细胞中金纳米棒的含量。
样品测试结果的标准不确定度来源包括但不仅限于：由测量平均值时重复性引起的不确定度、浓度
校准、仪器校准、标准曲线的不确定度分量组成。不确定度评定参见附录C。
10.1 活细胞内金纳米棒定量测定实例参见附录 B。
10.2 用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) 对消光光谱法进行验证参见附录 D。
10.3 消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式参见附录E。
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(资料性附录)
金纳米棒制备实例
A.1 金纳米棒水溶液的制备
A.1.1 概 述
金纳米棒水溶液的制备采用种子调制的生长方法，分两步完成。所用试剂纯度均为分析纯，所用水
为超纯水，电阻率为18 MQ ·cm。
A.1.2 金纳米晶晶种的制备
在30℃下恒温水浴中向浓度为0. 1 mol/L
的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入浓度为 10 mmol/L
的四氯金酸水溶液。在搅拌的条件下再向上述混合溶液中加入浓度为0.01 mol/L
的放置
于冰水浴中的硼氢化钠水溶液。其中十六烷基三甲基溴化铵水溶液、四氯金酸水溶液和硼氢化钠水溶
液混配的摩尔比为0.75:0.0025:0.006。搅拌该混合溶液2 min 后静置2
h,得到含有金纳米晶的金
晶种溶胶，所述金晶种溶液中金元素的浓度为0.25 mmol/L。
A.1.3 金纳米棒的制备
浓度为0.1 mol/L 的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中分别加入浓度为10 mmol/L
的四氯金酸水 溶液和浓度为10 mmol/L
的硝酸银水溶液，混合均匀后加入浓度为0.1 mol/L 的抗坏血酸水溶液，称
之为生长溶液。向其中加入(A.1.1)中制备的浓度为0.25 mmol/L
的金晶种溶胶，置入30℃下恒温水
浴中水浴12
h,得到含金纳米棒的金纳米棒溶胶。其中，十六烷基三甲基溴化铵水溶液、四氯金酸水溶
液、硝酸银水溶液、抗坏血酸水溶液与金晶种溶胶混配的摩尔比为5:0.025:0.005:0.0275:
0.000015。
A.2 聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDAC) 包覆金纳米棒的制备
按 A.1 制备1 L 金纳米棒溶胶，并在8600×g 转速下离心7
min,去掉上清液。加入1 g 聚苯乙烯 磺酸钠(PSS) 和0.176 g 氯化钠，定容到1
L,混合均匀。将样品置于室温(20℃~30℃)下放置1天~ 2天，即可获得 PSS
包覆的金纳米棒。将上述所得 PSS 包覆的金纳米棒，在8600×g 下离心10 min,
去掉上清液，加入5 mL 质量分数为20% PDDAC 溶液和0.176 g 氯化钠，定容到1
L,混合均匀。将样
品置于室温(20℃~30℃)下放置1天～2天，即可获得 PDDAC 包覆的金纳米棒。
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(资料性附录)
活细胞内金纳米棒定量测定实例
B.1 实验样品
金纳米棒(AuNRs, 长径比为4.2),以质量浓度为单位表示。
人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231。
B.2 实验内容
消光光谱法测定活细胞内金纳米棒的含量。
B.3 实验分析方法
用软件将光谱曲线进行平滑处理，然后用软件确定峰1的起点和终点，连接两点形成一条线段，对
横向峰与此线段围成的区域进行积分，即获得对应的峰面积。见图2。
取1.6×10⁵ MDA-MB-231 细胞接种于6孔板中，过夜培养。细胞与8μg/mL
浓度的AuNRs 孵育 12h, 然后将细胞收集并重悬于 PBS
中，经细胞计数仪计数并调整浓度至7.5×10⁵/mL。 取200 μL 细
胞悬液(含细胞数1.5×105)加入到酶标板中，进行 UV-Vis-NIR 光谱扫描。未经
AuNRs 暴露的细胞
作为对照样品。扣除对照样品的消光光谱后，即获得了细胞内 AuNRs
的消光光谱。
B.4 测试条件
Bio-rad TC10 全自动细胞计数仪。
BioTek Synergy4 多功能酶标仪：波长扫描范围：400 nm～999nm;
扫描速度：慢；波长间隔：1 nm。
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B.5
分析结果和表达方式
style="width:7.60014in;height:5.08662in" />
波长/nm
注：图中阴影区域为峰面积。
图 B.1 8 μg/mL金纳米棒与细胞孵育12 h
后，细胞内金纳米棒的消光光谱图
由图 B.1
计算出峰1面积为0.565,由图3的标准曲线得到对应的单个细胞内金纳米棒含量为
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(资料性附录)
不确定度评定示例
C.1 说 明
测量重复性引入的不确定度和标准曲线引入的不确定度评定示例。
C.2 测量重复性引入的标准不确定度 u; 的评估
测量重复性引入的标准不确定度 u; 采 用 A 类方法进行评定，关系式见式(C.
1):
style="width:4.83989in;height:0.77352in" /> ……… ………… (C.1)
式中：
s(x;)— 单次测量试验标准差；
m —— 给出测量结果时所作的测量次数；
n — 给出单次测量试验标准差时的测量次数；
x, —— 表示第 i 次测量值；
x — 为测量的平均值。
C.3 标准曲线引入的不确定度
标准曲线可表示为y=kc+b(c 为金纳米棒的浓度，y 为峰面积，k
为标准曲线的斜率，b 为标准曲
线的截距),则根据 JJF1059. 1—2012 中 A.3.2, 采用最小二乘法进行计算。
s²(b) 和 s²(k) 为试验方差，
r(b,k)=s(b,k)/s(b)s(k)
式中：
j=1,2, …,n;
c =(2c;)/n
则，当测试结果为
是估计的相关系数，其中 s(b,k) 是估计的协方差。
style="width:4.52679in;height:0.63998in" />
style="width:3.54in;height:0.63998in" />
style="width:1.91994in;height:0.64658in" />
style="width:1.55996in;height:0.62656in" />
style="width:2.51985in;height:0.7667in" />
style="width:2.88675in;height:0.64658in" />
D=n2(cj-c)²
时，标准曲线引入的不确定度：
u2=√s²(b)+x²s²(k)+2xs(b)s(k)r(b,k)
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(资料性附录)
用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) 对消光光谱法进行验证
D.1 实验样品
金纳米棒(AuNRs, 轴比为4.2),以质量浓度表示。
人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231。
D.2 实验内容
用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)
对消光光谱法测定活细胞内金纳米棒的含量进行验证。
D.3 实验分析方法
取1.6×105 MDA-MB-231
细胞接种于6孔板中，过夜培养。细胞与1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、
8μg/mL 和16μg/mL AuNRs孵 育 6 h,然后将细胞收集并重悬于 PBS
中，经细胞计数仪计数并调整
浓度至7.5×10⁵/mL。 取200 μL
细胞悬液(含细胞数1.5×105)加入到酶标板中，进行 UV-Vis-NIR 光 谱扫描。未经
AuNRs 暴露的细胞作为对照样品。扣除对照样品的消光后，即获得了细胞内 AuNRs
的
消光光谱。用8.1的方法计算出峰面积，用8.3的标准曲线转换为细胞中的金纳米棒含量。
另取200 μL 细胞悬液(含细胞数1.5×105)转入聚四氟乙烯消解管中，加入3 mL
浓硝酸(质量分 数63%)、6 mL 浓盐酸(质量分数37%)和1 mL
双氧水原液(质量分数30%),于微波消解仪上消解。
将所得的液体定容至40 mL, 然后用电感耦合等离子体质谱仪测定金元素含量。
比较两种方法测定的细胞中金纳米棒含量。
D.4 实验结果
消光光谱法测定的细胞内金纳米棒含量与 ICP-MS
方法的测定结果趋势一致，见图D.1。
style="width:5.93335in;height:4.47986in" />
培养基中金纳米棒浓度/(μg/mL)
图 D.1 消光光谱法测定细胞内金纳米棒含量与 ICP-MS
方法比较
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(资料性附录)
消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式
消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告
报告编号：
名称： 地址：
联系方式：
名称： 编号：
3 测试依据：
制造单位： 型号： 编号：
仪器检定/校准证书编号： 检 定 / 校 准 结 果 ：
比色皿： 温/湿度： 扫描波长范围： 扫描间隔：
扫描速度： 光谱带宽：
原始谱图：
标准曲线图及其方程：
k; b: 峰面积：
待测样品中金纳米棒的浓度：
测试人员： 校验人员： 测试日期：
结构名称： 地址：
8 授权结构： 授权证书编号：
style="width:3.09333in" />GB/T 33249—2016
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